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Preeflow計量閥ECO-PEN700日益見長

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實驗動物：斷奶后（2~6個月）的關(guān)中奶山羊，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)提供。主要試劑：胎牛血清、分離液、胰蛋白酶、EDTA、地塞米松、β-甘油磷酸鈉等試劑盒以及抗體均購于武漢博士德公司，其他試劑為國產(chǎn)分析提純。

1．2實驗方法

1．2.1動物模型選取選用斷奶后的關(guān)中奶山羊12只，雌雄不限，采用隨機區(qū)組設(shè)計的方法將實驗動物分成2組。1．2.2原代BMSCs的提取與培養(yǎng)選取斷奶的關(guān)中奶山羊，骨髓的抽取和MSCs的分離、培養(yǎng)按照馬勇江的方法進(jìn)行。

1．2.3細(xì)胞鑒定取培養(yǎng)第2代細(xì)胞，先用0.25%的胰蛋白酶消化，然后用PBS（磷酸鹽緩沖液）調(diào)整細(xì)胞濃度1×107個/ml，細(xì)胞鑒定采用CD34-FITC、CD90-PE、CD14-perCP、CD54-APC對細(xì)胞標(biāo)記，置4℃避光孵育30min以上，采用PBS洗1次，應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行表面抗原檢測。

1．2.4細(xì)胞誘導(dǎo)取第2代細(xì)胞移入HG-DMEM液進(jìn)行培養(yǎng)誘導(dǎo)。

1．2.5礦化誘導(dǎo)鑒定采用堿性磷酸酶染色鑒定。

1．2.6腺病毒介導(dǎo)的VEGF轉(zhuǎn)染選擇生長良好的傳代細(xì)胞，待其生長70%匯合時，用AdVEGF165轉(zhuǎn)染（感染倍數(shù)為50∶1），設(shè)置對照組（只加DMEM）。2組終末體積用含10%新生牛血清DMEM調(diào)5ml，24h后，換液加入含10%新生牛血清DMEM10ml中，于37℃、5%的CO2條件下培養(yǎng)。分別于第1、3、5、7、9、11、13和15d收獲上清,離心后-70℃保存。上清標(biāo)本統(tǒng)一用VEGFELISA試劑盒檢測VEGF濃度。

1．2.7復(fù)合物培育將環(huán)氧乙烷消毒備用的大小為30mm×5mm×5mm的珊瑚羥基磷灰石仿生人工骨分別放置于6個培養(yǎng)皿中，每皿分別加入濃度為2×106個/ml的已轉(zhuǎn)染成功的MSCs，然后放入5％的CO2、37℃孵箱中培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞在材料上及周邊的生長情況，并照相記錄。隔天換液，培養(yǎng)3d，備用。

1．2.8手術(shù)方法全身麻醉取俯臥位，備皮，采用2%碘伏消毒術(shù)區(qū)，沿雙側(cè)腰背筋膜縱向切開，分離長肌和多裂肌，顯露雙側(cè)L5、6棘突，去除部分皮質(zhì)骨后*止血，然后按照分組的不同于雙側(cè)橫突間各自植入基因增強人工骨骨條和自體骨條，肌肉覆蓋固定，后逐層縫合切口并包扎。于術(shù)前、術(shù)中、術(shù)后各用青霉素20×104U肌注，植入后1～3d每日20×104U青霉素肌注，植入后分欄飼養(yǎng)，不限活動。

1．2.9手法觸診檢查植入物硬度，輕柔檢測L5、6活動度，無活動判定為融合，有活動判定為不融合。

1．2.10影像學(xué)檢測術(shù)后4、8、12周每只山羊拍攝前后位X線片，觀察植骨處骨小梁長入情況。有連續(xù)骨小梁長入的判定為融合，其他情況為不融合。

1．2.11組織學(xué)檢測12周后將動物處死，取出植入物，福爾馬林固定24h，環(huán)鋸水平修整后脫水，甲基丙烯酸輕乙基酯（GMA）和甲基丙烯酸丁酯（BMA）混合液浸透后包埋、切片，厚度為5μm。切片行HE染色，觀察。

1．2.12生物力學(xué)檢測處死動物后取受力方向的骨塊，大小為4mm×4mm×3mm，用材料試驗機測試，加載速度為2mm/min。采用點壓技術(shù)和直徑2mm的圓柱形壓頭，計算壓穿軟骨下骨板時的壓縮強度（從開始加載的基點斷裂點峰值之間的壓力與壓頭面積的比值），在應(yīng)力應(yīng)變曲線上計量其彈性模量。

1．3統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間差異采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2．1細(xì)胞鑒定結(jié)果

剛接種的細(xì)胞為球形懸浮在胞液之中，混有少量的血細(xì)胞，4~5d后換細(xì)胞液，可見大量單核細(xì)胞呈圓形，未*貼壁；8~10d后換細(xì)胞液，可見單核細(xì)胞*貼壁，變成梭形及多角形，12d后大量單核細(xì)胞連接成片，形成纖維樣細(xì)胞集落，15~20d后細(xì)胞逐漸匯集，多呈長梭形及多角形，流式細(xì)胞儀檢測CD90和CD54為陽性，CD34和CD14為陰性，符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面抗原特征。

2．2成骨細(xì)胞誘導(dǎo)鑒定

12～14d基質(zhì)礦鹽形成鈣化結(jié)節(jié)，堿性磷酸酶染色可見胞漿被染成棕黑色，并有黑色顆粒沉積，說明培養(yǎng)形成的細(xì)胞具有成骨細(xì)胞的特性，具有體外成骨的能力（此種細(xì)胞含量超過80%）。

2．3VEGF轉(zhuǎn)染結(jié)果

結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF分泌顯著高于未轉(zhuǎn)染組（P<0.01），分泌高峰在7～9d，此后逐漸下降，15d仍然可檢測到，且依然高于對照組。

2．4手法觸診

所有實驗動物均存活且未見異常反應(yīng)，4周后均有活動度，8周后CHA-MSCs-VEGF組無活動度，12周后2組均無活動度。

2．5影像學(xué)檢測

4周后均未見骨小梁，8周后開始2組均可見骨小梁。

2．6組織學(xué)檢測

CHA-MSCs-VEGF組術(shù)后12周有少量軟骨及大量的連續(xù)骨小梁形成，可見皮質(zhì)骨圍繞，可見軟骨結(jié)構(gòu)形成，之后成骨，成骨代謝活性已非常接近正常，植入材料與骨組織達(dá)到骨性融合，自體髂骨組術(shù)后12周可見新生骨組織形成，但其成骨能力不及CHA-MSCs-VEGF組。

2．7生物力學(xué)檢測

CHA-MSCs-VEGF組與自體組在大壓縮強度和彈性模量2方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3討論

MSCs是近幾年來研究熱門的干細(xì)胞，具有在一定的培養(yǎng)條件下，可以分化為骨細(xì)胞，維持一定時期內(nèi)細(xì)胞的生長形態(tài)穩(wěn)定、增殖速度較快、細(xì)胞的生存適應(yīng)能力較強、貼壁時間短、成活率高等優(yōu)點，是目前骨組織工程中較為理想的種子細(xì)胞。本實驗采用Percoll梯度離心法，成功分離MSCs，并誘導(dǎo)其向成骨細(xì)胞分化。支架物質(zhì)CHA是以特定的天然優(yōu)質(zhì)珊瑚為原料，經(jīng)過一系列復(fù)雜的熱液置換反應(yīng)，將珊瑚中的礦物質(zhì)轉(zhuǎn)換為羥基磷灰石并保留了珊瑚天然的孔隙，得到物理結(jié)構(gòu)和無機成分與人體骨相似的產(chǎn)物，其不僅具有一定的機械強度和骨誘導(dǎo)物質(zhì)融合面積，而且其植入機體組織后有良好的生物相容性，不產(chǎn)生局部或全身性毒性反應(yīng)，無炎癥排斥反應(yīng)，具有良好的成骨潛能。為了促進(jìn)上述人工骨能更好地與機體組織融合，本研究還加入了血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），其為機體內(nèi)促進(jìn)血管生長的重要的生長因子，在體內(nèi)外均可以特異性促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長并誘導(dǎo)血管生成。*，臨床骨折的愈合快慢與病損處血供有著密切的關(guān)系，將VEFG基因轉(zhuǎn)染入人工骨的構(gòu)建之中，可促進(jìn)骨組織血管的形成、加速骨質(zhì)間的融合和生長。本實驗中，由觸診和影像學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，該基因增強人工骨在融合速度上快于自體髂骨，從組織切片上可看出，其成骨的質(zhì)量上比自體髂骨更加成熟，在生物力學(xué)的檢測中，該人工骨在大壓縮強度和彈性模量上均接近正常骨組織。綜上所述，CHA-MSCs-VEGF三聯(lián)人工骨復(fù)合物具有取材方便、培養(yǎng)簡單、相容性好、成骨迅速、生物力學(xué)強度高等優(yōu)點，有望廣泛應(yīng)用于臨床植骨融合手術(shù)中骨骼的替代材料。